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王肖 唐恺

赛默飞展位

11月15日12:15-13:15，赛默飞特举办生物制药工艺与质量控制完整解决方案专题闭门研讨会，实现线上线下同步直播。赛默飞色谱质谱部生物制药业务发展经理唐恺向到场150余位代表及线上观众介绍赛默飞生物医药质谱的高分辨质谱深入表征方案。指出：

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完整蛋白表征是蛋白质药物产品（如单抗）研发与质控中最常进行的分析项目。包括完整分子量及还原分子量测定，切N糖后分子量测定，轻重链分子量测定，抗体-化学药物偶联物（ADC）分子量及DAR（Drug to Antibody）值分析等。

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Orbitrap高分辨轨道阱技术分辨率可达14万以上，对单抗类药物而言，多电荷m/z2000-4000之间，分辨率优势明显，更容易实现基线分离，可将质量精度控制在10ppm以内(以15万Da的单抗为例，相当于1.5Da)，同时兼备高分辨率和高灵敏度。对于ADC药物而言，根据单抗的氨基酸序列理论分子质量进行计算，将观察到的质谱峰进行归属后，可计算该ADC单抗分子结合的药物小分子分子量，同时根据质谱峰的峰强度信息，还可以计算得到该药物的DAR值，该数值对于ADC 药物的有效性评估至关重要。

在蛋白质药物产品的质控要求中，需要对蛋白氨基酸序列进行确证，对相关修饰进行鉴定以及定量——即肽图分析。

肽图的液质实验流程主要包括：蛋白的变性、蛋白酶酶解（通常使用胰蛋白酶 Trypsin）、液质联用数据采集、数据处理几个步骤。SMART Digest试剂盒含样品预处理试剂包括变性，还原，烷基化试剂，快速酶解，结果稳定、重复性好。Orbitrap高灵敏度和高质量精度的特点——区分共洗脱和质量相近的组分，同时对序列变异体、后修饰、糖基化和杂质进行有效分析和相对含量测定。

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二硫键是单抗轻重链之间链接半胱氨酸残基中的键，为了确定蛋白质的一级结构，首先必须将二硫键打开，使成为线状多肽链。二硫键对稳定蛋白质药物的空间结构，保持其活性具备重大的作用。主要检测是为了：1）对期望二硫键连接的验证；2）对位置（错配）二硫键的发现。传统的二硫键分析与二硫键的直接分析法对比发现，传统的方式灵敏度差、分析通量低、不同分析人员造成的分析结果差异较大。

直接采集非还原蛋白质药物肽图质谱数据，并通过化软件自动化查找二硫键。二硫键的解析对软件的要求很高，需要有极其强大的数据处理性能。Biopharma Finder软件源于国际知名药企Amgen 内部自制的肽图分析软件，因此其功能设计从一开始就听从了一线分析人员的切实需求， 而Thermo Fisher 的加入，则使软件底层对质谱数据处理的性能大大提高。

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此外，高级结构还包括二级、三级结构，即利用蛋白质的圆二色性即不对称分子对左右圆偏振光吸收的不同来进行结构分析，热稳定性分析（DSC）测定Tm值等。

翻译后修饰主要包括糖基化位点，糖型分析，氨基酸修饰分析，唾液酸分析等。糖基化对蛋白药物的疗效，稳定性，免疫原性具有重要点影响。液质联用在蛋白药物糖基化分析中主要包括：寡糖解析，糖肽分析，糖基化位点确认等。

GlycanPac AXH-1/AXR-1 色谱柱结合了弱阴离子交换WAX 和亲水相互作用HILIC (AXH-1)/ 反相RP (AXR-1) 两种保留机理，能够高效率地分析复杂寡糖链混合样本。经典 HILIC/RP 机理可以根据电荷数、极性、大小实现寡糖链分离，而WAX 机理保留和选择带负电荷的寡糖链，对含唾液酸的寡糖链具有很好的分离效果。Orbitrap 由于具有超高分辨率和超高灵敏度，无论对于单抗等纯蛋白样品、还是全细胞蛋白等复杂样品，都是是糖基化位点表征的最佳工具。

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蛋白药物的团聚现象会影响药物的生物活性及诱导患者的免疫反应，临床上安全推荐加入吐温（Tween，聚山梨醇酯，Polysorbate）20 或80 作为辅料以提高蛋白药物的稳定性。但吐温具有溶血副作用，所以法规明确规定每日摄取量不超过25 mg·kg-1 ——(FDA/WHO,1985 )

CAD电喷雾式检测器作为一种新型的、质量型通用检测器，无需发色团或离子化，可检测任何非挥发性和半挥发性物质，只与质量相关，无关分子结构，具有4个数量级的线性范围，低至ng级的灵敏度，RSD<2%的重现性，完美解决了蛋白药物中辅料检测难题。

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